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Introducción

La Pseudomona aeruginosa (o Pseudomona pyocyanea) es una bacteria Gram-negativa, aerobia estricta, oxidasa (+), no esporulada, con motilidad unipolar y capaz de crecer a 42 ºC. Es un patógeno oportunista en humanos y también en plantas. Como otras Pseudomonas, P. aeruginosa secreta una variedad de pigmentos como piocianina (azul verdoso), fluoresceína (amarillo verdoso fluorescente) y piorubina (rojo pardo).

El medio que utilizamos es Agar Cetrimida, este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomona Aeruginosa. Está formulado de forma que estimula la formación de pigmentos. La cetrimida (Bromuro de Cetiltrimetilamonio) es un detergente catiónico que actua como inhibidor de otras bacterias, liberando el N y el P de las células de casi toda la flora acompañante.

Observar los pigmentos de piocianina (azul verdoso) o fluoresceína (amarillo verdoso fluorescente) puede considerarse como prueba presuntiva para su identificación. Posteriormente pueden utilizarse otras pruebas como confirmatorias.

Para preparar el medio debemos tomar 45,3 gramos, disolverlo en 1 litro de agua destilada y agregar 10 ml de glicerol (glicerina) como fuente de C y energía. Reposamos 10 – 15 minutos, calentamos agitando hasta p.eb. durante 1 minuto, esterilizamos en autoclave a 121 ºC 15 minutos y al atemperar, verter en placas Petri estériles.

Además de ser selectivo, el medio está formulado para favorecer la formación del pigmento de piocianina azul o azul verdoso por Pseudomonas aeruginosa mediante la adición de cloruro de magnesio y sulfato de potasio. Este pigmento se difunde en el medio que rodea al crecimiento.

El glicerol sirve como fuente de energía y también favorece la producción de piocianina.

Una vez que obtengamos el resultado, sembraremos en otra placa para obtener un cultivo puro, y le realizaremos varias pruebas bioquímicas para confirmar que es pseudomona:

       a - Una de ellas es el color que toma el medio debido a sus pigmentos, observaremos que es un color verde fosforito, que probablemente sea debido a la mezcla del azul-verdoso de la piocianina con el amarillo de la fluoresceína.

       b - A continuación le hacemos una tinción de Gram, y efectivamente comprobamos que es un bacilo Gram (-) si vemos claramente colonias de bacilos rojos y no observamos ninguna otra bacteria.

       c - Posteriormente puede utilizarse la prueba de la oxidasa como confirmatoria, sobre un trozo de papel de filtro.

Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. Por lo general, el sistema citocromo oxidasa sólo se encuentra en los organismos aerobios y algunos anaerobios facultativos, con esto diferenciaremos Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias. El reactivo de la oxidasa más usado es la solución al 1% de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Este reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a púrpura-negruzco.

       d - Por último, aún realizaremos una prueba más, la de la movilidad, ya que Pseudomona Aeruginosa es un bacilo móvil con flagelo, para ello inoculamos una muestra de bacterias en un cubre con una gota de agua y le ponemos encima un porta (técnica de la gota pendiente), y la observamos al microscopio, efectivamente comprobaremos que los bacilos se mueven, unos mas rápido que otros y de diferentes formas.

 

Material y productos

Material

 

Productos

Cantidad

  Equipo de filtración estéril

1

 

  Medio Agar Cetrimida

 

  Pinza flameable de extremos planos

1

 

  Agua de peptona estéril

 

  Filtros de membrana (47 mm de diámetro y 0,45 μm de poro

 

 

  Colorante para tinción de Gram

 PNT 5

  Placas Petri estériles

 

 

  Reactivo de Kovacs

 

  Pipetas automáticas

 

 

  Muestras de agua

 

  Estufa de cultivo (44ºC)

 

 

 

 

  Material para la tinción de Gram

PNT 5

 

 

 

  Porta excavado y cubre

 

 

 

 

 

Procedimiento

·         Preparamos el medio de cultivo Agar Cetrimida según el PNT correspondiente.

·         Preparamos agua de peptona tamponada según el PNT correspondiente.

·         Colocar un filtro de membrana estéril con las pinzas estériles sobre el soporte del equipo de filtración.

·         Filtramos 50 ml de la muestra problema con el vacío necesario.

·         Lavamos con 30 ml de agua de peptona estéril.

·         Retiramos el filtro con pinzas estériles y lo ponemos en la placa Petri con medio de cultivo.

·         Incubamos a 42ºC durante 48 horas (previamente etiquetado).

·         Hacemos un conteo de las UFC, y expresamos el resultado como nº de colonias / 250 mL.

·         Realizamos las pruebas bioquímicas especificadas (Pigmentos, tinción de Gram, oxidasa y movilidad).

 

Diagrama

 

Resultados

Aun no observadas las placas sembradas, pero si, tenemos el cultivo puro y hemos confirmado que es pseudomona observando los pigmentos verde fosforitos en la placa. También con la tinción de Gram, donde se veían muy bien los bacilos rojos. También se observaba marrón-negro sobre el papel de filtro en la prueba de la oxidasa (dio positiva) y en la prueba de movilidad también dio positivo ya que observamos que se movían.

Otras páginas consultadas:

http://imb.usal.es/Practicas2/P2/Practicas2.pdf  (Practicas 2º de microbiologia Universidad de Salamanca)
Jose A. Cortes, “Manual de laboratorio de ensayos microbiológicos”. Ed. Libros en red.
http://www.slideshare.net/sangel06/manual-de-medio-de-cultivos